2. 创建MultiAssayExperiment对象

本章节主要介绍如何将多组学项目数据导入分析流程。

2.1 创建多组学项目的MultiAssayExperiment对象

当用户处理多个组学项目的数据时，需要将数据导入并组合成一个MAE对象。

2.1.1 创建组学样本编号与受试者编号关系表

在研究中，每名受试者都具有唯一的受试者编号(例如：P1，P2，P3...)，每名受试者可能会采集多种生物样本，测得多种组学项目的数据，包括16s rRNA基因测序的物种注释（taxonomy）、微生物功能基因的KO注释（geno_ko）、微生物功能基因的ec酶注释(geno_ec)等。在分析单一或多个组学项目的数据时，多数情况下受试者编号和组学项目样本编号是相同的（例如：受试者编号为P1，组学项目名称为taxonomy，组学项目样本编号为P1）。但有时候我们也会面临以下几种情况：

仅为单一组学项目：受试者编号和组学项目样本编号不一致（例如：受试者编号为P1，组学项目名称为taxonomy，组学项目样本编号为tax_1）；
包含多个组学项目：同一名受试者中，不同组学项目的样本编号不一致（例如：受试者编号为P1；组学项目名称为taxonomy，对应的组学项目样本编号为tax_1；组学项目名称为geno_ko，对应的组学项目样本编号为genomics_1）。

因此，为了有效地管理和分析这些数据，用户需要建立一张关系表（通常命名为dfmap，用户也可以自行命名），将受试者编号与组学项目样本编号对应起来。基于关系表，用户才能将所有数据顺利地导入到 MultiAssayExperiment 对象中。在后续的分析过程中，EasyMultiProfiler 包会自动根据关系表，将组学项目数据中的样本编号自动替换为受试者编号。

以关系表为基础的分析流程具有以下优势：

数据整合与一致性: 通过关系表，可以确保不同组学项目的数据集中的样本信息被正确地映射和整合，从而保证数据的一致性。
自动化处理: 可以自动化地管理和处理数据，无需手动修改，因此不用担心出现命名不一致的情况。
简化分析流程: 将数据整合并自动将样本编号替换为受试者编号后，分析流程更为流畅和清晰，减少了手动处理可能导致的错误。

注意：
请勿混淆“组学项目名称”、“受试者编号”和“组学项目样本编号”。

🏷️示例：创建受试者编号与组学项目样本编号的关系表。

此表需要保存为文件，读入R中。用户也可以手动在R内通过数据框直接创建。

dfmap <- read.table('dfmap.txt',header=TRUE,sep='\t')

注意：
①关系表必须由以下三列组成：assay（组学项目名称）、primary（受试者编号）、colname（组学项目样本编号）。
②组学项目样本编号（例如：本教程中的tax_1、genomics_1等）是由上游注释流程产生，一般不需要用户做特别修改。
③允许组学项目样本编号与受试者编号一致（例如：受试者编号为P1，组学项目名称为taxonomy，组学项目样本编号为P1）。
④每个组学项目的样本编号（或与样本编号对应的受试者编号）必须是样本相关数据受试者编号的子集（或完全相同）。如果组学项目中的样本编号在样本相关数据受试者编号中无对应，应当在这些组学项目中剔除这些样本编号。
⑤每个组学项目的样本编号必须与关系表的colname逐一对应。
⑥同一批受试者干预前后组学项目数据的编号方案，请参考10.3章节。

2.1.2 读取样本相关数据注意事项

样本相关数据是指受试者的基本信息，通常包括：受试者的一般人口学资料（性别、年龄、居住地等）、人体测量学资料（身高、体重、腰围等）、心理量表评分结果（焦虑量表、抑郁量表、睡眠量表等）、检验结果（血常规、肝功能、炎性因子等）等。

注意：
①样本相关数据中如果存在缺失值，请直接置空，不要用NA、-、missing等字符占位。
②样本相关数据的第一列请设置为样本编号，在读取时将其设置为行名（重要）。
③样本编号必须是唯一的，不能有重复。
④建议将数据中分类变量的取值设置为字符串，不要使用纯数字，避免引发不必要的问题。
⑤同一批受试者干预前后组学项目数据的编号方案，请参考10.3章节。
⑥样本名称请勿使用(-，^)等R不便于识别的符号,必要时使用下划线(_)替代。

## row.names=1 必须将样本名作为行名
meta_data <- read.table('col.txt',header = T,row.names = 1)

2.1.3 读取微生物组学数据

微生物组学数据是指通过各种微生物上游注释工具产出的、包含各个样本内微生物丰度信息的结果文件。常见的结果文件包括以下五种类型：ASV/OTU表格、界门纲目科属种级别丰度表、MetaPhlan和Humann产生的带有层级关系的丰度表、BIOM文件、QIIME2专属的QZV文件。模块EMP_taxonomy_import支持以上全部格式的结果文件输入，并将其转化为SummmariseExperiment对象。

2.1.3.1 ASV/OTU表格

此文件内第一行和第二行的#字符无需修改。数据文件内必须要包含taxonomy的物种注释信息。

注意：
①该数据文件必须包含名为taxonomy列。
②taxonomy列必须包含微生物注释列。
③建议使用;对微生物注释进行分割。

tax_data <- EMP_taxonomy_import('tax.txt',duplicate_feature=TRUE)

2.1.3.2 门纲目科属种级别丰度表

由于高分类级别数据可以转换为低分类级别数据（例如：Species数据可转换为Phylum数据），因此建议用户直接导入最高分类级别的数据。

注意：
模块EMP_taxonomy_import的参数assay_name默认为counts(绝对丰度)；如果实际数据为相对丰度，可输入relative(相对丰度)。

tax_data <- EMP_taxonomy_import('tax.txt')

2.1.3.3 MetaPhlan和Humann的分类注释表

此注释表的物种注释具有层级结构，通常包含界门纲目科属种各级别的全部结果信息。模块EMP_taxonomy_import可以自动识别最高分类级别的注释信息，并导入完整分类数据。

注意：
输入的数据为此种格式时，需要将在模块EMP_taxonomy_import内指定参数humann_format=TRUE。

tax_data <- EMP_taxonomy_import('tax.txt',humann_format=TRUE)

2.1.3.4 Biom格式文件

Biom格式是QIIME1流程中常见的物种注释结果文件，部分用户也会将QIIME2流程的物种注释文件保存为biom格式便于数据存储。模块EMP_taxonomy_import可以直接读取biom格式文件，并导入数据信息。

注意：
输入的数据为此种格式时，需要将在模块EMP_taxonomy_import内指定file_format='biom'。

tax_data <- EMP_taxonomy_import('tax.biom',
                                file_format='biom',duplicate_feature=TRUE)

2.1.3.5 Biom格式文件转化后的表格文件

Biom文件可以利用biom convert方法转换成表格文件，也可以直接导入。

注意：
输入的数据为此种格式时，无需修改表头和#符号。

tax_data <- EMP_taxonomy_import('tax.txt',duplicate_feature=TRUE)

2.1.3.6 qzv格式文件

在Qiime2流程qiime taxa barplot会产生微生物注释结果qzv文件。模块EMP_taxonomy_import可以直接读取qzv格式文件，并导入数据信息。

注意：
输入的数据为此种格式时，需要将在模块EMP_taxonomy_import内指定file_format='qzv'。

tax_data <- EMP_taxonomy_import('tax.qzv',
                                file_format='qzv',duplicate_feature=TRUE)

2.1.4 读取KO/EC组学数据

2.1.4.1 普通表格形式

普通格式的KO/EC组学项目数据是指宏基因组或宏转录组学注释的、以KO或EC编号注释的结果文件。模块EMP_function_import可以直接读取注释表格，并查询KEGG数据库整合对应的注释信息。

注意：
①编码中必须是纯KO和EC编号，例如:不能为KO:K00010，而必须仅为K00010；不能为ec:1.1.1.1,而必须仅为1.1.1.1。
②模块EMP_function_import内参数assay_name默认为counts（绝对丰度），用户需要根据实际数据输入TPM、FPKM等。

ko_data <- EMP_function_import('ko.txt',type = 'ko')
ec_data <- EMP_function_import('ec.txt',type = 'ec')

2.1.4.1 Humann格式

Humann格式的KO/EC组学项目数据是指由Humann工具产生的分层KO/EC注释表。模块EMP_function_import会忽略UNGROUPED的信息，直接读取注释表格，并查询KEGG数据库整合对应的注释信息。

注意：
文件的表头需要清理干净，删除#等字符。

ko_data <- EMP_function_import('ko.txt',type = 'ko',humann_format = TRUE)

2.1.5 读取标准表格信息

标准表格数据通常是指转录组或代谢组等数据，这类数据没有特殊格式，可直接导入。

2.1.5.1 不含特征注释信息的数据导入

本数据常见于转录组或基因组数据，“行”为特征，“列”为样本。

tran_data <- EMP_normal_import('tran.txt')

2.1.5.2 包含特征注释信息的数据导入

本数据常见于代谢组学数据，“行”为特征，“列”为样本编号和特征相关注释。导入这种数据时，需要指定样本编号列。

注意：
①可直接通过sampleID指定样本编号。
②可直接通过关系表指定样本编号。

# 直接指定样本编号
sample_ID <-c("Control1", "Control10", "Control2", "Control3", "Control4", 
        "Control5", "Control6", "Control7", "Control8", "Control9",
        "Treat10", "Treat1", "Treat2", "Treat3", "Treat4", "Treat5", 
        "Treat6", "Treat7", "Treat8", "Treat9")
metbol_data <- EMP_normal_import('metabol.txt',sampleID = sample_ID)

# 利用关系表来判断样本编号
metbol_data <- EMP_normal_import('metabol.txt',sampleID = sample_ID,
                                 dfmap = dfmap,assay = 'untarget_metabol')

2.1.6 整合全部数据导入MultiAssayExperiment对象

注意：
①本示例中的dfmap即2.1.1中的关系表。
②关系表内的assay必须转换为因子。
③objlist内命名必须与关系表assay列的组学项目名称一致。
④如组装失败，可以用模块MultiAssayExperiment::prepMultiAssay(objlist,meta_data,dfmap)检查数据情况。
⑤更多有关MultiAssayExperiment包的详细信息可以参考此教程。

#### 关系表的assay必须转换为因子
dfmap$assay <- as.factor(dfmap$assay)

#### objlist内命名必须与关系表assay列的组学项目名称一致
objlist <- list("taxonomy" = tax_data,
                "geno_ko" = ko_data,
                "geno_ec" = ec_data,
                "untarget_metabol" = metbol_data,
                "host_gene" = geno_data)

MAE <- MultiAssayExperiment::MultiAssayExperiment(experiments=objlist, 
                                                  colData=meta_data, 
                                                  sampleMap=dfmap)

2.2 快速创建单组学项目的MultiAssayExperiment对象

当用户只有单一的组学项目数据（例如：微生物组学项目数据或转录组学项目数据），可通过模块EMP_easy_import快速构建MAE对象，直接进行下游分析流程。

注意：
①type参数包含tax、ko、ec和normal四种方式，需要用户根据上文判断使用。
②由于单一组学项目不涉及创建关系表，因此丰度矩阵的样本编号必须与样本相关数据中的样本编号一致。

## row.names=1 必须将样本编号作为行名
meta_data <- read.table('col.txt',header = T,row.names = 1)
MAE <- EMP_easy_import('tran.txt',coldata = meta_data,type = 'normal')
MAE <- EMP_easy_import('tax.txt',coldata = meta_data,type = 'tax')
MAE <- EMP_easy_import('ko.txt',coldata = meta_data,type = 'ko')

2.3 MultiAssayExperiment对象存放与读取

当创建完成MAE对象后，可以将其存入本地以便下次分析时直接读取，而无需重复创建步骤。

注意：
在存储前，请务必正确设置R的本地工作目录，数据文件将存储在该工作目录下。

# Save in your working diectory
saveRDS(MAE,file = 'MAE.rds')
# Load the object 
MAE <- readRDS(file = 'MAE.rds')

2.4 示例数据以及脚本

示例数据：下载地址

library(EasyMultiProfiler)

## 加载表型数据
meta_data <- read.table('coldata.txt',header = T,row.names = 1)

## 加载样本表
dfmap <-read.table('dfmap.txt',header = T) %>% 
  dplyr::mutate(assay = factor(assay))

## 加载组学数据
tax_data <- EMP_taxonomy_import('tax.txt')

ko_data <- EMP_function_import('ko.txt',type = 'ko')

ec_data <- EMP_function_import('ec.txt',type = 'ec')

metbol_data <- EMP_normal_import('metabol.txt',dfmap = dfmap,assay  = 'untarget_metabol')

geno_data <- EMP_normal_import('tran.txt',dfmap = dfmap,assay  = 'host_gene')


## 组合成列表
objlist <- list("taxonomy" = tax_data,
                "geno_ko" = ko_data,
                "geno_ec" = ec_data,
                "untarget_metabol" = metbol_data,
                "host_gene" = geno_data
)

## 创建MAE对象
MAE <- MultiAssayExperiment::MultiAssayExperiment(objlist, meta_data, dfmap)

## 存储数据对象以备下次分析使用
saveRDS(object = MAE,file = 'demo_data.rds')

## 下次分析时直接读取对象，而无需再次组装
MAE <- readRDS('demo_data.rds')

Chapter 2 Import data